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2月6日，記者從中國(guó)科學(xué)院青島生物能源與過程研究所(以下簡(jiǎn)稱“青島能源所”)獲悉，該所單碳酶催化研究組首次開發(fā)出工程化P450酶，成功實(shí)現(xiàn)了不飽和烴的直接硝化，進(jìn)而通過晶體學(xué)研究和自由基捕獲與控制實(shí)驗(yàn)，揭示了直接硝化反應(yīng)機(jī)理。這一研究成果不但為生物催化硝化開辟了新的途徑，而且為促進(jìn)P450工程酶的過氧化物酶功能在合成化學(xué)和合成生物學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用提供了新思路。相關(guān)研究成果近日已在線發(fā)表于國(guó)際期刊《德國(guó)應(yīng)用化學(xué)》。

硝基化合物作為一種高附加值的化工中間體，在醫(yī)藥、農(nóng)藥、炸藥等領(lǐng)域均有廣泛應(yīng)用。目前工業(yè)硝化具有產(chǎn)物選擇性差，環(huán)境污染嚴(yán)重以及反應(yīng)條件苛刻等多種缺陷。盡管條件溫和的生物硝化方法是值得期待的可替代途徑，然而自然界已知的硝化酶僅有N-加氧酶、過氧化物酶和細(xì)胞色素P450酶幾種，且普遍存在催化效率低、底物譜窄和產(chǎn)物區(qū)域選擇性差等不足，遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足工業(yè)應(yīng)用的需求。因此開發(fā)新型生物硝化酶具有重要意義。

近年來，青島能源所單碳酶催化研究組在國(guó)際上首次提出雙功能小分子(DFSM)協(xié)同P450酶催化概念，成功構(gòu)建了人工P450過加氧酶催化體系，實(shí)現(xiàn)了氣態(tài)烷烴分子的選擇羥化、苯乙烯的高度R-對(duì)映選擇性環(huán)氧化、碳-氫鍵區(qū)域和立體多樣性選擇羥化。此外，研究人員利用酶化學(xué)機(jī)制指導(dǎo)的蛋白質(zhì)工程策略，成功開發(fā)出雙功能分子協(xié)同P450催化的過氧化物酶新功能，拓展了P450酶的化學(xué)應(yīng)用空間，為開發(fā)碳-氫鍵氧化官能化提供了新策略。

機(jī)制引導(dǎo)的蛋白質(zhì)工程策略實(shí)現(xiàn)P450酶催化不飽和烴直接硝化。王曦翎、叢志奇制圖

研究人員在上述工作基礎(chǔ)上，運(yùn)用酶工程技術(shù)，在過氧化反應(yīng)中起關(guān)鍵作用的氨基酸位點(diǎn)引入空間位阻效應(yīng)，阻止底物靠近活性中心發(fā)生過加氧反應(yīng)，強(qiáng)化其過氧化物酶功能，首次開發(fā)出工程化P450酶，成功實(shí)現(xiàn)了不飽和烴的直接硝化。通過疊加底物口袋關(guān)鍵位點(diǎn)突變，使底物譜范圍覆蓋19個(gè)芳香化合物和9個(gè)末端芳基烯烴化合物，獲得了迄今為止催化效率最高、底物范圍最廣的人工P450硝化酶。其中4-氟苯酚的硝化活性最高，其半制備反應(yīng)的分離產(chǎn)率達(dá)到49%。

關(guān)鍵詞： 不飽和烴 過氧化物酶 研究人員 催化效率 蛋白質(zhì)工程