蛋白質(zhì)是生命活動的主要承擔(dān)者。測量組成蛋白質(zhì)的氨基酸的排列順序被稱為蛋白質(zhì)測序。由于缺乏普適、高效的測序技術(shù)，人類對蛋白質(zhì)的了解還極其有限，生命世界的諸多奧秘仍待破解。

近日，浙江大學(xué)化學(xué)系馮建東團隊提出了基于固體納米孔的氨基酸識別方法。他們構(gòu)建了直徑為1納米左右的人工納米孔，可進(jìn)行單個氨基酸分子的精準(zhǔn)識別，分辨率達(dá)到0.94道爾頓。這顯示出人工納米孔應(yīng)用于單分子蛋白質(zhì)測序的可能性。相關(guān)研究論文發(fā)表于《自然·通訊》。

一項持續(xù)了60多年的挑戰(zhàn)

1951年，英國科學(xué)家弗雷德里克·桑格完成了對胰島素的測序工作，并因此獲得諾貝爾化學(xué)獎。這是人類第一次測定蛋白質(zhì)的氨基酸組成，從此人們認(rèn)識到蛋白質(zhì)具有特定的氨基酸序列。

(相關(guān)資料圖)

但此后，桑格在蛋白質(zhì)測序方面陷入了持續(xù)10年的瓶頸期。他轉(zhuǎn)而嘗試進(jìn)行DNA測序和RNA測序，發(fā)明了后來被稱為“桑格測序法”的雙脫氧測序法。該方法被廣泛應(yīng)用于測定基因和基因組序列，這項發(fā)明改寫了整個生命科學(xué)的研究進(jìn)程和途徑，引領(lǐng)了人類三大科學(xué)計劃之一的基因組計劃和基因測序領(lǐng)域的飛速發(fā)展。

基因測序方法發(fā)展迅猛，而與之相較，蛋白質(zhì)測序發(fā)展無疑是滯后的。“蛋白質(zhì)測序‘起跑’比基因測序早，但沒有像基因測序技術(shù)那樣被廣泛應(yīng)用。”浙江大學(xué)生命科學(xué)研究院研究員蔣超說，比起基因，人們對蛋白質(zhì)的了解要少得多。基于此，一種普適高效的蛋白質(zhì)測序手段的誕生有著重大意義。

相比于基因測序，蛋白質(zhì)測序遇到的主要困境在于其結(jié)構(gòu)復(fù)雜且構(gòu)成的單元氨基酸具有更強的異質(zhì)性，這意味著蛋白質(zhì)測序手段所需的檢測靈敏度要高得多。蛋白質(zhì)也沒有類似核酸擴增的技術(shù)，導(dǎo)致目前人們難以分析低豐度蛋白質(zhì)，因此在單分子層面上對蛋白質(zhì)進(jìn)行測序的需求日益迫切。

蔣超介紹，目前測量蛋白質(zhì)的氨基酸序列的主流方法是利用質(zhì)譜儀，但此方法在檢測速度、讀取長度和靈敏度方面還存在很多不足之處，其效力遠(yuǎn)不及基因組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)。

“納米孔主要可分為兩大類，一類是生物納米孔，一類是固體納米孔，目前應(yīng)用較多的生物納米孔本身由肽鏈折疊而成，所以其靈敏度受限于納米孔本身的尺寸。”馮建東認(rèn)為，要解決蛋白質(zhì)測序的研究需求，必須從根本上突破傳統(tǒng)納米孔靈敏區(qū)域的長度限制。

納米孔“盲盒”挑戰(zhàn)測量極限

想搞懂納米孔測序，不妨將其理解為一個拆盲盒的過程。假設(shè)盲盒里有一條項鏈，玩家僅知道這條項鏈由幾顆珠子構(gòu)成，不同顏色珠子的排列方式要靠猜測。

馮建東說，盲盒里如果是某個基因“項鏈”，對應(yīng)基因有4種不同的堿基，猜的就是4種顏色珠子的排列順序。而對于蛋白質(zhì)“項鏈”來說，組成蛋白質(zhì)的有20種天然氨基酸，其排列組合數(shù)量就將飆升到天文數(shù)字。

“結(jié)構(gòu)決定分辨能力。如果我們把單個的孔做到足夠小，只容許孔內(nèi)有一個氨基酸分子，那么它的信息就有可能被精確識別。”馮建東介紹，團隊嘗試人工創(chuàng)造一個具有單個氨基酸敏感性區(qū)域、幾乎是目前世界上最小的人工納米孔，這樣納米孔測量的“盲盒”內(nèi)就可以僅存1個氨基酸。

“類似于不同體型的人過一扇窄門，有的人可以順利通過，有的人則會被擋在門外。”馮建東說，科研人員通過電壓在一張三層原子厚度的二硫化鉬上“戳”出一個洞，其實是讓它丟掉一些原子，開出一扇僅容許一個氨基酸通過的“門”。這扇“門”的直徑在亞納米到1.6納米之間。

“不同氨基酸的體積不同，且表面帶一定的電荷，當(dāng)它們通過納米孔時，通過納米孔的離子電流會受到微小的擾動。當(dāng)不同的氨基酸經(jīng)過這扇‘門’時，受到的擾動程度就會不一樣。”團隊成員、浙江大學(xué)化學(xué)系博士生王馥實介紹，研究人員通過區(qū)分?jǐn)_動程度來識別不同的氨基酸。

蛋白質(zhì)單分子測序再進(jìn)一步

研究人員通過對納米孔的極限結(jié)構(gòu)的設(shè)計，將當(dāng)前納米孔測量分辨率推進(jìn)到0.94道爾頓，實現(xiàn)了直接分辨單個氨基酸分子的目標(biāo)，并且可在同一納米孔內(nèi)區(qū)分16種不同類型的天然氨基酸，解決了納米孔蛋白測序空間分辨率的核心難題。

馮建東認(rèn)為，使用納米孔高精度識別單個氨基酸的策略，為納米孔單分子蛋白質(zhì)測序提供了物理解析的可行性基礎(chǔ)。

自然界的蛋白質(zhì)分子有著難以想象的復(fù)雜性，除了序列，不同的化學(xué)修飾的變化也會產(chǎn)生豐富的“變異”，而這些“變異”與人類疾病息息相關(guān)。比如，蛋白質(zhì)的異常糖基化修飾會導(dǎo)致多種重大疾病，如白血病、阿爾茨海默病等。

蛋白質(zhì)的磷酸化修飾在細(xì)胞周期、生長、凋亡和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等過程中起著重要的調(diào)控作用。在這項工作中，研究人員實現(xiàn)了用納米孔來識別氨基酸的磷酸化。這一結(jié)果表明納米孔未來有望應(yīng)用于醫(yī)學(xué)檢測，助力疾病診斷和預(yù)防。

“目前，我們的方法可以用于分辨不同的單個氨基酸分子;將來，希望能夠一次性識別更復(fù)雜組合的多肽鏈，以及復(fù)雜的化學(xué)修飾。”馮建東表示，蛋白質(zhì)測序是目前納米孔領(lǐng)域最受關(guān)注的應(yīng)用之一，單個氨基酸分子的識別是一個好的開端，后續(xù)如何完成對從氨基酸到肽鏈，再到復(fù)雜折疊的蛋白質(zhì)的識別仍是更大的挑戰(zhàn)和機遇。

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